Омилҳои дахолат дар реаксияҳои PCR

Ҳангоми реаксияи PCR, аксар вақт баъзе омилҳои халалдор дучор мешаванд.
Аз сабаби ҳассосияти хеле баланди ПЗР, ифлосшавӣ яке аз омилҳои муҳимтарини таъсир ба натиҷаҳои PCR ҳисобида мешавад ва метавонад натиҷаҳои мусбати бардурӯғ ба вуҷуд орад.
Сарчашмаҳои гуногуне, ки ба натиҷаҳои бардурӯғ-манфӣ оварда мерасонанд, якхела муҳиманд. Агар як ё якчанд қисмҳои муҳими омехтаи ПТР ё худи реаксияи амплификатсия монеъ шавад ё халал расонад, санҷиши ташхис метавонад монеъ шавад. Ин метавонад боиси кам шудани самаранокӣ ва ҳатто натиҷаҳои манфии бардурӯғ гардад.
Илова ба ҷилавгирӣ, аз даст додани якпорчагии кислотаи нуклеинӣ дар натиҷаи интиқол ва/ё шароити нигоҳдорӣ пеш аз тайёр кардани намуна метавонад ба амал ояд. Махсусан, ҳарорати баланд ё нигоҳдории номуносиб метавонад боиси вайрон шудани ҳуҷайраҳо ва кислотаҳои нуклеинӣ гардад. Фиксатсияи ҳуҷайраҳо ва бофтаҳо ва ҷобаҷогузории парафин сабабҳои маълуми порашавии ДНК ва мушкилоти доимӣ мебошанд (ниг. Расмҳои 1 ва 2). Дар ин мавридҳо ҳатто изолятсияи оптималӣ ва тозакунӣ кӯмак намекунад.

Расми 1 | Таъсири иммобилизатсия ба тамомияти ДНК
Электрофорези гели агарозӣ нишон дод, ки сифати ДНК, ки аз қисмҳои парафинии автопсия ҷудо карда шудааст, хеле фарқ мекунад. Вобаста аз усули фиксатсия дар иқтибосҳо ДНК-и дарозии миёнаи гуногуни фрагментҳо мавҷуд буданд. ДНК танҳо вақте нигоҳ дошта мешуд, ки дар намунаҳои яхкардашудаи ватанӣ ва дар формалини нейтралии буферӣ ҷойгир карда шудааст. Истифодаи як фиксатори сахт кислотаи Буин ё формалини дорои кислотаи форминӣ буферӣ боиси талафоти назарраси ДНК гардид. Қисми боқимонда хеле пароканда аст.
Дар тарафи чап, дарозии порчаҳо бо ҷуфтҳои килобазаҳо (kbp) ифода карда мешаванд.

Расми 2 | Аз даст додани якпорчагии ҳадафҳои кислотаи нуклеинӣ
(а) Холати 3′-5′ дар ҳарду ришта боиси шикастани ДНК-и мақсаднок мегардад. синтези ДНК ҳанӯз дар порчаи хурд рух медиҳад. Бо вуҷуди ин, агар дар порчаи ДНК макони коркарди ибтидоӣ мавҷуд набошад, танҳо амплификацияи хатӣ ба амал меояд. Дар ҳолати аз ҳама мусоид, пораҳо метавонанд ҳамдигарро барқарор кунанд, аммо ҳосилнокӣ хурд ва аз сатҳи муайянкунӣ пасттар хоҳад буд.
$B) гум шудани асосњо, асосан аз натиљаи депуринатсия ва ташаккули димери тимидин боиси кам шудани адади пайвандњои Н- ва камшавии Тм ​​мегардад. Дар марҳилаи гармшавии тӯлонӣ, праймерҳо аз ДНК-и матритса гудохта мешаванд ва ҳатто дар шароити камтар сахттар об намешаванд.
$C) Асосњои тиминии њамшафат димери ТТ-ро ташкил медињанд.
Мушкилоти дигари маъмуле, ки аксар вақт дар ташхиси молекулавӣ рух медиҳад, ин баровардани камтар аз оптималии кислотаҳои нуклеинӣ дар муқоиса бо истихроҷи фенол-хлороформ мебошад. Дар ҳолатҳои шадид, ин метавонад бо манфиҳои бардурӯғ алоқаманд бошад. Бо ҷӯшидани лизис ё ҳазми ферментативии партовҳои ҳуҷайра вақти зиёдро сарфа кардан мумкин аст, аммо ин усул аксар вақт ба ҳассосияти пасти PCR аз сабаби нокифоя будани кислотаи нуклеин оварда мерасонад.

Моҳияти фаъолияти полимераз ҳангоми амплификация

Умуман, монеъшавӣ ҳамчун консепсияи контейнер барои тавсифи ҳама омилҳое истифода мешавад, ки ба натиҷаҳои пастсифати PCR оварда мерасонанд. Ба маънои қатъии биохимиявӣ, монеъшавӣ бо фаъолияти фермент маҳдуд аст, яъне табдили субстрат-маҳсулотро тавассути ҳамкорӣ бо макони фаъоли полимеразаи ДНК ё кофактори он (масалан, Mg2+ барои полимеразаи Так ДНК) коҳиш медиҳад ё пешгирӣ мекунад.
Компонентҳо дар намуна ё буферҳои гуногун ва экстрагентҳо, ки дорои реагентҳо мебошанд, метавонанд мустақиман ферментро боздоранд ё кофакторҳои онро (масалан EDTA) банд кунанд ва ба ин васила полимеразро ғайрифаъол гардонанд ва дар навбати худ ба кам ё нодурусти натиҷаҳои ПТР оварда расонанд.
Бо вуҷуди ин, бисёр таъсироти мутақобила байни ҷузъҳои реаксия ва кислотаҳои нуклеинӣ дорои ҳадаф низ ҳамчун "ингибиторҳои PCR" таъин карда мешаванд. Вақте ки тамомияти ҳуҷайра бо ҷудошавӣ вайрон мешавад ва кислотаи нуклеинӣ озод мешавад, байни намуна ва маҳлули атрофи он ва фазаи сахт метавонад ба амал ояд. Масалан, 'хостагирон' метавонанд ДНК-и якқатор ё дуқабатаро тавассути таъсири мутақобилаи ғайриковалентӣ бипайванданд ва ба ҷудошавӣ ва поксозӣ тавассути кам кардани шумораи ҳадафҳое, ки дар ниҳоят ба зарфи реаксияи ПТР мерасад, халал расонанд.
Умуман, ингибиторҳои ПТР дар аксари моеъҳои бадан ва реагентҳое мавҷуданд, ки барои санҷишҳои клиникии ташхис истифода мешаванд (мочевина дар пешоб, гемоглобин ва гепарин дар хун), иловаҳои ғизоӣ (компонентҳои органикӣ, гликоген, чарб, ионҳои Ca2+) ва ҷузъҳои муҳити зист (фенолҳо) , металлҳои вазнин)

Ингибиторҳои бештари ПТР-ро дар бактерияҳо ва ҳуҷайраҳои эукариотӣ, ДНК-и ғайриҳадаф, макромолекулаҳои ДНК-и матритсаҳои матоъ ва таҷҳизоти лабораторӣ ба монанди дастпӯшакҳо ва пластикҳо пайдо кардан мумкин аст. Тоза кардани кислотаҳои нуклеинӣ ҳангоми истихроҷ ё пас аз истихроҷ усули афзалиятнок барои хориҷ кардани ингибиторҳои PCR мебошад.
Имрӯз, таҷҳизоти гуногуни истихроҷи автоматӣ метавонанд бисёр протоколҳои дастӣ иваз карда шаванд, аммо 100% барқарорсозӣ ва / ё тозакунии ҳадафҳо ҳеҷ гоҳ ба даст оварда нашудааст. Ингибиторҳои потенсиалӣ метавонанд дар кислотаҳои нуклеинҳои тозашуда мавҷуд бошанд ё аллакай амал карда бошанд. Барои кам кардани таъсири ингибиторҳо стратегияҳои гуногун мавҷуданд. Интихоби полимерази мувофиқ метавонад ба фаъолияти ингибиторҳо таъсири назаррас расонад. Дигар усулҳои исботшудаи коҳиш додани ҷилавгирӣ аз PCR баланд бардоштани консентратсияи полимеразҳо ё истифодаи иловаҳо ба монанди BSA мебошанд.
Пешгирии реаксияҳои ПТР-ро тавассути истифодаи назорати сифати равандҳои дохилӣ (IPC) нишон додан мумкин аст.
Барои тоза кардани ҳама реагентҳо ва дигар маҳлулҳо дар маҷмӯаи экстраксия, аз қабили этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол ва фенол, аз изолятсияи кислотаи нуклеинӣ бо қадами шустани ҳамаҷониба эҳтиёт шудан лозим аст. Вобаста аз консентратсияи онҳо, онҳо метавонанд PCR-ро фаъол ё боздоранд.