Омилҳои дахолат дар реаксияҳои PCR

Ҳангоми реаксияи PCR, аксар вақт баъзе омилҳои халалдоркунанда дучор мешаванд.
Аз сабаби ҳассосияти хеле баланди PCR, олудагӣ яке аз омилҳои муҳимтарин ба натиҷаҳои PCR ҳисобида мешавад ва метавонад натиҷаҳои бардурӯғи мусбат ба бор орад.
Манбаъҳои гуногуне, ки ба натиҷаҳои бардурӯғи манфӣ оварда мерасонанд, ба ҳамин андоза муҳиманд. Агар як ё якчанд қисмҳои муҳими омехтаи PCR ё худи реаксияи амплификация монеъ ё халалдор карда шаванд, санҷиши ташхисӣ метавонад халалдор шавад. Ин метавонад ба паст шудани самаранокӣ ва ҳатто ба натиҷаҳои бардурӯғи манфӣ оварда расонад.
Илова бар монеа, аз даст додани якпорчагии кислотаи нуклеинии мақсаднок метавонад аз сабаби шароити интиқол ва/ё нигоҳдорӣ пеш аз омода кардани намуна ба амал ояд. Аз ҷумла, ҳарорати баланд ё нигоҳдории нокифоя метавонад боиси вайрон шудани ҳуҷайраҳо ва кислотаҳои нуклеинӣ гардад. Фиксатсияи ҳуҷайра ва бофтаҳо ва ҷойгиркунии парафин сабабҳои маълуми фрагментатсияи ДНК ва мушкилоти доимӣ мебошанд (нигаред ба расмҳои 1 ва 2). Дар ин ҳолатҳо, ҳатто ҷудокунӣ ва тозакунии оптималӣ кӯмак намекунад.

Расми 1 | Таъсири иммобилизатсия ба якпорчагии ДНК
Электрофорези гелии агароз нишон дод, ки сифати ДНК-и ҷудошуда аз қисматҳои парафинии аутопсия ба таври назаррас фарқ мекунад. Вобаста ба усули фиксатсия, дар экстрактҳо ДНК-и дарозии миёнаи фрагментҳои гуногун мавҷуд буд. ДНК танҳо вақте нигоҳ дошта мешуд, ки дар намунаҳои яхкардашудаи табиӣ ва дар формалини бетарафи буферӣ фиксатсия карда мешуд. Истифодаи формалини фиксатории Буин ё бебуфер, ки дорои кислотаи формик аст, боиси талафоти назарраси ДНК гардид. Фраксияи боқимонда хеле фрагментатсияшуда аст.
Дар тарафи чап, дарозии пораҳо бо ҷуфтҳои килобаза (кбп) ифода карда мешавад.

Расми 2 | Аз даст додани якпорчагии ҳадафҳои кислотаи нуклеинӣ
(а) Фосилаи 3′-5′ дар ҳарду ришта боиси шикастани ДНК-и мақсаднок мегардад. Синтези ДНК ҳанӯз ҳам дар порчаи хурд ба амал меояд. Аммо, агар дар порчаи ДНК нуқтаи гармкунии праймер мавҷуд набошад, танҳо амплификацияи хаттӣ ба амал меояд. Дар ҳолати мусоидтарин, порчаҳо метавонанд якдигарро дубора сер кунанд, аммо ҳосилнокӣ хурд ва аз сатҳи ошкоркунӣ пасттар хоҳад буд.
(б) Аз даст додани асосҳо, асосан аз ҳисоби депуринатсия ва ташаккули димери тимидин, боиси кам шудани шумораи пайвандҳои H ва кам шудани Tm мегардад. Дар марҳилаи тӯлонии гармкунӣ, праймерҳо аз ДНК-и матритса об мешаванд ва ҳатто дар шароити камтар сахт гарм намешаванд.
(в) Асосҳои тимини ҳамшафат димери TT-ро ташкил медиҳанд.
Мушкилоти дигари маъмуле, ки аксар вақт дар ташхиси молекулавӣ ба миён меояд, ин камтар аз оптималӣ раҳо шудани кислотаҳои нуклеинии мақсаднок дар муқоиса бо истихроҷи фенол-хлороформ мебошад. Дар ҳолатҳои фавқулодда, ин метавонад бо натиҷаҳои манфии бардурӯғ алоқаманд бошад. Бо ҷӯшонидани лизис ё ҳазми ферментативии партовҳои ҳуҷайра вақти зиёдро сарфа кардан мумкин аст, аммо ин усул аксар вақт бо сабаби нокифоя раҳо шудани кислотаҳои нуклеинӣ ба ҳассосияти пасти PCR оварда мерасонад.

Боздоштани фаъолияти полимераза ҳангоми амплификация

Умуман, ингибисия ҳамчун мафҳуми контейнерӣ барои тавсифи ҳамаи омилҳое, ки ба натиҷаҳои зероптималии PCR оварда мерасонанд, истифода мешавад. Дар маънои қатъии биохимиявӣ, ингибисия танҳо ба фаъолияти фермент маҳдуд аст, яъне он табдили маҳсулоти субстратро тавассути таъсири мутақобила бо маркази фаъоли полимеразаи ДНК ё кофактори он (масалан, Mg2+ барои полимеразаи ДНК Taq) кам ё пешгирӣ мекунад.
Компонентҳо дар намуна ё буферҳо ва экстрактҳои гуногун, ки дорои реагентҳо мебошанд, метавонанд ферментро мустақиман боздоранд ё кофакторҳои онро (масалан, EDTA) ба даст оранд ва бо ин васила полимеразаро ғайрифаъол кунанд ва дар навбати худ ба натиҷаҳои PCR-и паст ё манфии бардурӯғ оварда расонанд.
Аммо, бисёр таъсири мутақобила байни ҷузъҳои реаксия ва кислотаҳои нуклеинии дорои ҳадаф низ ҳамчун "ингибиторҳои PCR" номида мешаванд. Пас аз он ки якпорчагии ҳуҷайра тавассути ҷудокунӣ вайрон мешавад ва кислотаи нуклеинӣ раҳо мешавад, таъсири мутақобила байни намуна ва маҳлули атрофи он ва фазаи сахт метавонад ба амал ояд. Масалан, "хомӯшкунакҳо" метавонанд тавассути таъсири мутақобилаи ғайриковалентӣ ДНК-и як ё дуқабата пайваст шаванд ва бо кам кардани шумораи ҳадафҳое, ки дар ниҳоят ба зарфи реаксияи PCR мерасанд, ба ҷудокунӣ ва тозакунӣ халал расонанд.
Умуман, ингибиторҳои PCR дар аксари моеъҳои бадан ва реагентҳое, ки барои санҷишҳои ташхисии клиникӣ истифода мешаванд (мочевина дар пешоб, гемоглобин ва гепарин дар хун), иловаҳои парҳезӣ (компонентҳои органикӣ, гликоген, равған, ионҳои Ca2+) ва ҷузъҳои муҳити зист (фенолҳо, металлҳои вазнин) мавҷуданд.

Ингибиторҳои PCR-и маъмултарро дар бактерияҳо ва ҳуҷайраҳои эукариотӣ, ДНК-и ғайриҳадафӣ, макромолекулаҳои ба ДНК пайвастшавандаи матритсаҳои бофта ва таҷҳизоти лабораторӣ, ба монанди дастпӯшакҳо ва пластикҳо, пайдо кардан мумкин аст. Тозакунии кислотаҳои нуклеинӣ ҳангоми ё баъд аз истихроҷ усули афзалиятноки хориҷ кардани ингибиторҳои PCR мебошад.
Имрӯз, таҷҳизоти гуногуни истихроҷи автоматӣ метавонанд бисёр протоколҳои дастиро иваз кунанд, аммо барқароркунии 100% ва/ё тозакунии ҳадафҳо ҳеҷ гоҳ ба даст наомадааст. Ингибиторҳои эҳтимолӣ метавонанд то ҳол дар кислотаҳои нуклеинии тозашуда мавҷуд бошанд ё аллакай амал карда бошанд. Стратегияҳои гуногун барои кам кардани таъсири ингибиторҳо мавҷуданд. Интихоби полимеразаи мувофиқ метавонад ба фаъолияти ингибитор таъсири назаррас расонад. Усулҳои дигари исботшуда барои кам кардани ингибитории PCR ин зиёд кардани консентратсияи полимераза ё истифодаи иловаҳо ба монанди BSA мебошанд.
Боздоштани реаксияҳои PCR-ро метавон бо истифода аз назорати сифати равандҳои дохилӣ (IPC) нишон дод.
Эҳтиёт бояд шуд, ки ҳамаи реагентҳо ва дигар маҳлулҳои дар маҷмӯаи экстракция мавҷудбуда, ба монанди этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол ва фенол, аз изоляти кислотаи нуклеинӣ бо қадами шустани пурра тоза карда шаванд. Вобаста аз консентратсияи онҳо, онҳо метавонанд PCR-ро фаъол ё боздоранд.